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一、 核心原理：稀釋與分離
平板劃線法的核心思想非常簡單：“稀釋”。
想象一下，你有一杯非常濃的果汁，想要品嘗到最純粹的一滴水，你會不斷地加水稀釋它。平板劃線法也是同理，只不過我們稀釋的對象是混雜的菌液，而“水”變成了固體的培養基。
1、固體培養基的作用：我們使用添加了瓊脂的固體培養基。它像一塊果凍，為微生物提供了生長的固定場所。一個微生物細胞被固定在一個位置后，會不斷分裂繁殖，形成成千上萬個相同的子代細胞，最終形成一個肉眼可見的、由一個祖先繁衍而來的菌落。
2、劃線的目的：通過接種環在平板表面有規律地劃線，其物理動作實際上是在將菌液一次次地“抹開”。每劃完一個區域，接種環上的菌液數量就減少一個數量級。經過幾輪的劃線稀釋，最終，個別微生物細胞會被單獨留在平板表面的某個點上。
3、純菌落的出現：這些被單獨留下的細胞經過一段時間的培養（通常18-24小時），就會生長形成孤立、獨立的單個菌落。這個菌落理論上就是由一個細胞繁殖而來的純種，即我們所需的“純培養”。
二、 所需材料與準備工作
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培養基：適于待分離微生物生長的瓊脂平板（如牛肉膏蛋白胨培養基用于細菌，PDA培養基用于真菌）。
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接種工具：接種環。
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樣品：含有待分離微生物的混雜菌液或樣品懸液。
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其他：無菌工作臺（超凈工作臺或酒精燈提供無菌環境）、恒溫培養箱、標記筆等。
關鍵：整個操作過程必須在無菌條件下進行，防止空氣中的雜菌污染平板，導致分離失敗。
三、 標準操作步驟（以最常用的四區劃線法為例）
四區劃線法是最高效、最易獲得單菌落的方法，非常適合初學者。
1、標記與準備：在平板底部用標記筆注明樣品信息、日期和操作者姓名。將接種環在酒精燈外焰上徹底灼燒至通紅，然后冷卻片刻。
2、取菌：用冷卻后的無菌接種環伸入菌液樣品或斜面上，蘸取少量菌種。
3、第一區劃線：將沾有菌種的接種環在平板培養基表面的一側（約占1/4面積）進行密集的、不重疊的“之”字形劃線（如圖A區）。此區域菌液濃度最高，菌落會長得非常密集，甚至連成一片。
4、二次灼燒：完成第一區后，立即將接種環在火焰上灼燒滅菌，殺死環上剩余的菌液。等待接種環冷卻！（否則會燙死下一區的微生物）
5、第二區劃線：將冷卻的無菌接種環穿過第一區的劃線區域1-2次，然后在不與第一區交叉的空白區域（B區）進行新一輪的“之”字形劃線。此時，接種環上僅沾有從第一區帶來的少量細菌，實現了第一次稀釋。
6、三次灼燒與第三區劃線：再次灼燒接種環，冷卻后，穿過第二區1-2次，在空白區域（C區）劃線，進行第二次稀釋。
7、四次灼燒與第四區劃線：最后一次灼燒接種環，冷卻后，穿過第三區，在最后的空白區域（D區）進行劃線，完成最終稀釋。
8、培養：劃線完成后，將平板倒置（防止冷凝水滴落沖散菌落），放入恒溫培養箱中，在適宜溫度下培養18-24小時。
四、 結果判讀與純化
培養后，取出平板觀察。你會看到：
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第一區：菌落密集，難以區分。
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第二、三區：菌落數量減少，逐漸出現分散的單個菌落。
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第四區： ideally，會出現彼此分離、間隔良好的單個菌落。
這些單個菌落通常形態、大小、顏色、光澤一致。此時，你需要用無菌接種環輕輕挑取一個你認為最理想的獨立菌落，將它重新劃線或接種到新的斜面培養基上。經過再次培養，由此得到的培養物就是該微生物的純培養。
五、 成功的關鍵與技巧
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無菌操作是生命線：任何污染都會讓實驗前功盡棄。
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接種環冷卻要徹底：熱接種環會殺死微生物，導致無菌生長。
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劃線的力度要輕柔：切勿劃破培養基表面，否則菌會滲入培養基內部，影響菌落形態和分離效果。
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合理分區：確保后一區的劃線僅與前一區有少量交叉，這樣才能有效稀釋。
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練習造就完美：熟練的劃線手法需要反復練習才能達到最佳稀釋效果。
六、 應用與意義
平板劃線分離法不僅是微生物學實驗教學的“第一課”，更是所有微生物相關研究和應用的基礎：
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臨床診斷：從病人樣本（如痰、血液、尿液）中分離致病菌，是確定感染原、進行藥敏試驗的第一步。
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食品工業：分離發酵菌種（如酵母菌、乳酸菌），或檢測食品中的腐敗菌和致病菌。
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環境微生物學：從土壤、水樣中分離具有特定功能（如降解污染物、固氮）的微生物。
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科學研究：獲得純培養是研究微生物遺傳、生理、代謝等所有特性的先決條件。
總結而言，平板劃線分離法以其簡潔的設計、強大的功能和低廉的成本，成為了微生物學領域經久不衰的經典技術。它就像一位精巧的工匠，用最簡單的工具——一個接種環和一塊平板，成功地將混亂的微生物世界分解成一個個可供我們研究和利用的純粹個體。
